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论文解读--诺卡氏菌通过激活线粒体半胱天冬酶途径诱导牛乳腺上皮细胞凋亡

出处:水生动物健康评估公众号 作者:枫桥夜泊 激情图区天天影视网 2019-08-26 15:02:00

据报道诺卡氏菌是人类和动物的细胞内病原体。诺卡氏菌可导致局部或全身性诺卡氏菌病,伴有脓或肉芽肿,可能通过吸入、摄入或创伤性植入传播,并可通过淋巴和血液循环传播。引起诺卡氏菌病的最重要物种包括奶牛乳腺炎诺卡氏菌、杀鲑诺卡氏菌、巴西诺卡氏菌、鼻疽诺卡氏菌和新星诺卡氏菌。
  
在人类中,诺卡氏菌病的常见表现为肺诺卡氏菌病、中枢神经系统(CNS)诺卡氏菌病、肺外诺卡氏菌病、皮肤、皮下或淋巴皮肤诺卡氏菌病和诺卡氏菌血症。在牛中,它与慢性鼻疽、流产、肺和全身性诺卡氏病有关。
  在许多细菌病原体中,线粒体依赖性凋亡途径被公认为主要的致病策略。在此过程中,凋亡因子打开线粒体通透性过渡孔,最终导致膜电位损失和细胞色素C活化。然后细胞色素C结合凋亡蛋白酶激活因子I(apaf-I),诱导寡聚。因此,apaf-1寡聚体与caspase-9的组装形成凋亡复合体。caspase-9随后通过caspase-3激活触发凋亡。然而,在BMEC中,capsase-9激活触发N.cyriacigeorgica细胞凋亡的具体机制尚不清楚。
  今天,与大家一起学习一篇关于诺卡氏菌对BMEC的细胞死亡效应的文章,文章信息如下:
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粘附和入侵实验
  细菌粘附和入侵被认为是感染过程中的重要致病和毒力因素,一些体内和体外实验表明,诺卡氏菌具有粘附和侵入各种类型细胞的能力,从而导致细胞和组织损伤。诺卡氏菌感染可诱导巨噬细胞和树突状细胞分化为泡沫细胞。此外,诺卡氏菌的入侵甚至可以导致噬菌体溶酶体融合的预防、蛋白酶体活性的抑制、抗氧化杀伤的抵抗、噬菌体酸化的阻塞以及巨噬细胞溶酶体酶活性的改变。

乳酸脱氢酶(LDH)释放实验
LDH是一种酶,通常存在于细胞质中,细菌感染后可通过受损细胞膜释放到细胞培养基中。低密度脂蛋白释放分析可用于评价环孢菌对BMEC的细胞病变作用。如图1所示,在感染1,3,6小时后测得有LDH的释放。但是在感染12和18小时后,LDH的释放与对照组相比,有显著的上升。这些结果表明随着时间的推移,N. cyriacigeorgica会对BMEC细胞膜造成严重的损伤。
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DNA片段化评估
作为凋亡细胞死亡的一个特征,DNA梯被应用于细胞凋亡的验证。DNA片段如图2所示。对照组、1、3、6h组和N.cyriacigeorgica对照组BMEC均未见DNA梯状带出现。但在感染组12和18小时,观察到明显的典型DNA梯状带。这些结果表明,N.cyriacigeorgica能诱导骨髓基质细胞凋亡/坏死,感染后12小时观察到凋亡DNA片段。
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细胞凋亡/坏死分析
 采用膜联蛋白v/pi双染色法分析早期凋亡细胞和晚期凋亡/坏死细胞。图3感染后1和3 h出现的局限性凋亡/坏死。感染后6h细胞早期凋亡率明显高于对照组(P<0.01)。相对于对照组,感染后6 h细胞凋亡略有增加,感染后12 h和18 h细胞凋亡/坏死变化较感染前显著增加(P<0.01)。此外,12 h和18h时,晚期细胞凋亡/坏死率均比早期细胞凋亡率高(P<0.01)。此外,18 h(52.26%)总死亡率明显高于12h(46.99%)。这些数据表明,N.cyriacigeorgica能引起细胞凋亡和坏死,并呈时间依赖性增强。
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扫描电镜分析
为进一步证实bMECs感染N.cyriacigeorgica后的粘附性、侵袭性、LDH释放和细胞死亡,利用扫描电镜(SEM)检测了bMECs感染N.cyriacigeorgica后与细胞损伤的相互作用。对照组未见形态学改变(图4A)。感染后6 h,形态学改变为细胞表面部分bMECs和短诺卡菌丝轻度断裂(图4B,C)。在12和18 h感染后,bMECs明显收缩,细胞变态,脱皮,细胞膜破裂,与球形突出出现在某些细胞表面,丰富增长菌丝体覆盖细胞和纤维细胞膜渗透到细胞外和细胞内(图4 d I)。特别是在6、12或18 h,扫描电镜结果表明,细胞表面的微绒毛被诺卡氏菌属完全包裹纤维(图4 e、h I)。因此,这些细胞形态的变化表明,N.cyriacigeorgica的渗透和存活可能是上述细胞损伤的原因。
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透射电镜分析
用透射电镜(TEM)观察bMECs感染葡萄球菌后nocardial细胞的内化及超微结构的变化。感染细胞的超微结构变化如图5所示,包括感染后6 h内质网肿胀、嵴退变、线粒体肿胀、核周间隙扩张(图5D F);在12 h后感染,泡在细胞表面形成,细胞膜破裂,核膜,染色质凝集,碎片和着边染色质被发现(图5 g I)。最后,严重破坏的细胞,细胞器,线粒体内密集颗粒积累和观察,在18 h感染后(图5 j L)。此外,Nocardial细胞被发现在细胞质和细胞核。这些观察结果显示了由临床N. cyriacigeorgica感染引起的细胞逐渐坏死的过程。
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凋亡分析
前期(1 ~ 6 h)处于相对稳定的线粒体膜电位状态,nocardial感染晚期12 ~ 18 h,线粒体膜电位明显减少(p < 0.01),与对照组比较(见图6)。
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  细胞色素c、caspase-9和caspase-3的western blot结果如图7所示。感染后1 h线粒体细胞色素c释放逐渐增加(p<0.05),从1 h开始caspase-9的活化显著高于对照组(p< 0.01),感染后3 h caspase-3的活化显著高于对照组(p<0.05)。
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细胞内诺卡菌的生长表明,与对照组相比,12 h后细胞凋亡率明显增加(p < 0.01)(图8A,B)。12、18 h时,死亡细胞大多处于早期凋亡阶段(p<0.01)。此外,bMECs总死亡率18 h(19.70%)明显高于12 h (15.80%) (p < 0.01)。令人惊讶的是,革兰氏染色显示诺卡菌呈短棒状,在16小时内无明显生长;然而,它们在12和18 h时萌发成独特的长菌丝形式,导致感染细胞的病理形态学改变(图8C)。细菌计数结果表明,不同培养时间的诺卡菌总数与对照组相比无显著差异。类似的结果枚举的胞内诺卡氏菌属也发现在12 h。这是根据细胞凋亡分析,提出了细胞凋亡显著增加在12和18 h。细胞内细菌明显减少(p < 0.01)在18 h与对照组相比(图8 d)。革兰氏染色结果和诺卡菌数的不变表明,细胞内和细胞外N.cyriacigeorgica在18 h的孵育过程中都是由小棒向菌丝生长而不是繁殖(图8C,D)。在Nocardia生长旺盛的12、18 h,细胞凋亡明显加剧(图8A C)。
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结语
这些结果表明临床N.cyriacigeorgica能够粘附和侵入bMEC,导致细胞膜破坏和线粒体变性。文章的数据支持这样的假设:N.cyriacigeorgica通过细胞凋亡机制诱导宿主细胞死亡,并且N.cyriacigeorgica感染的后期在bMECs中遵循线粒体依赖性凋亡途径。这些研究结果表明,bMECs的细胞凋亡是通过触发caspase级联诱导的,并可能对牛乳腺组织中N.cyriacigeorgica感染的机制提供重要的见解。

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